Temario
PROGRAMA:
1 - FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
1.1 - Relación fundamental de la cromatografía
1.2 - Principales parámetros cromatográficos
. tiempo y volumen de retención
. factor de capacidad
. coeficiente de distribución
1.3 - Teoría del ensanchamiento de banda
. modelización de la columna cromatográfica
. eficiencia y número de platos teóricos
. factores que afectan la eficiencia
. curva de Van Deemter con variables reducidas y reales
1.4 - Resolución
. expresión de la resolución
. factores que afectan la resolución
1.5 - Presión en HPLC
. ley de Darcy
. influencia de los diferentes parámetros sobre la presión
1.6 - Consecuencias de la HPLC sobre la instrumentación
. volumen del pico cromatográfico
. eficiencia observada/eficiencia real
. congruencia del sistema con respecto a la columna
. reglas generales sobre volúmenes muertos
. presión
2 - MECANISMOS DE RETENCION EN CROMATOGRAFIA DE INTERACCION
2.1 - Termodinámica de las disoluciones
. parámetros termodinámicos
. interacciones solvente/solvente y soluto / solvente
. parámetro de solubilidad
. noción de polaridad, escalas de polaridad
2.2 - Mecanismo de retención de tipo fase normal, cromatografía de
adsorción
. adsorbentes, estructura
. interacciones en fase estacionaria
. modelo de retención de SNYDER
. escala eluotrópica
. actividad de la fase estacionaria
. equilibrio de distribución del agua
. noción de disolventes isoactivantes
2.3 - Mecanismo de retención de tipo fase normal, cromatografía en
fases injertadas o impregnadas
. las fases estacionarias
. interacciones
. escala eluotrópica
. diferencias de comportamiento entre fases
2.4 - Intercambio iónico
. mecanismo de retención, constante de distribución
. intercambio de cationes, escala eluotrópica
. intercambio de aniones, escala eluotrópica
. las fases de intercambio iónico
. mecanismos secundarios del intercambio iónico: equilibrio de Donnan
. exclusión de iones, intercambio de ligandes
. ejemplos
2.5 - Mecanismo de retención de tipo fase inversa
. efecto hidrofóbico
. aplicación al mecanismo de retención en fase inversa
. fases estacionarias
. parámetros que rigen la retención
. predicción de la retención
. retención/solubilidad
2.6 - Cromatografía de pares de iones
. cromatografía de fase inversa con moléculas ionizables
. influencia del PH
. adsorción del reactivo de pares de iones
. mecanismos de retención
. parámetros que rigen la retención
2.7 - Fases inversas reales : mecanismos mixtos
. mecanismo secundario de fase normal : ventajas/desventajas
. tratamiento secundario de la fase estacionaria : "end capping"
. fase estacionaria de tipo "base desactivated"
. nuevas generaciones de fases con sílices ultra puras, consecuencias
sobre la retención y eficiencia
. nuevas generaciones de fases con mecanismo mixto inducido
. otras fases estacionarias
2.8 - Fases normales reales : mecanismos mixtos
. mecanismos secundarios de fase inversa con fases normales
ventajas/desventajas
. caso particular de la fase amino : 3 mecanismos simultáneos
2.9 - Cromatografía de moléculas de alto peso molecular
. límites de la HPLC clásica
. fase de diámetro de poros grande
. aplicación a la separación de polipéptidos y proteínas
2.10 - Fases comerciales
. las diferentes generaciones de sílices comerciales,
. descripción de la estructura de las fases comerciales más comunes.
3 - MECANISMO DE RETENCION EN CROMATOGRAFIA DE PERMEACION
3.1 - Base teórica
. parámetros cromatográficos
. termodinámica de la retención
. mecanismo de retención, peso molecular, volumen hidrodinámico
3.2 - GPC de polímeros no solubles en agua
. fases y columnas
. calibración, modelización
3.3 - GPC de polímeros solubles en agua
. fases y columnas
. problemas específicos
3.4 - GPC de polipéptidos y proteínas
. fases y columnas
. pH, fuerza iónica y aditivos en fase móvil
4 - CROMATOGRAFIA DE MOLECULAS QUIRALES
4.1 - Reglas generales
. puntos de interacción
. interacción quiral
4.2 - Separación con fase móvil quiral
. ejemplos
4.3 - Separación con fase estacionaria quiral
. fases tipo PIRKLE
. fases tipo celulosa
. fases tipo proteína
. fases tipo ciclodextrina
5 - DESARROLLO Y OPTIMIZACION DE LA SEPARACION CROMATOGRAFICA
5.1 - Selección de la técnica cromatográfica
. principales criterios de selección
. criterios de selección en función de la estructura de los solutos
5.2 - Optimización de la separación
. resolución
. tiempo de análisis
. modelos matemáticos
. gradiente de concentración de fase móvil
. costo
6 - PREPARACIÓN DE MUESTRA
6.1 - Compatibilidad de la muestra con respecto al sistema cromatográfico
6.2 - Técnicas de preparación
. clásicas
. derivatización
. micro columnas
6.2 - Cromatografía bidimensional
. "Back flush"
. purificación y concentración en línea
. "heart cutting"
7 - ANALISIS CUANTITATIVO
7.1 - Respuesta del detector
. relación fundamental
. medida de la superficie y altura de pico
. precisión
. normalización interna
7.2 - Método del estándar externo
. principio, cálculo
. precisión
7.3 - Método del estándar interno
. principio, cálculos
. precisión
7.4 - Método de adición patrón
. principio, cálculos
. precisión
7.5 - Curva de calibración
. propósito, interés
. uso según el método
8 - VALIDACION DEL METODO
8.1 - Generalidades
. definición
. criterios preliminares
. plan de validación
8.2 - Parámetros de evaluación
. precisión
. exactitud
. límite de detección
. límite de cuantificación
. linealidad
. selectividad específica
. solidez
